血漿凝固酶試驗(yàn)原理

病原性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶試驗(yàn)對于判定該菌株是否具有致病力，很有幫助。葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。

葡萄球菌所產(chǎn)生的凝固酶有以下兩種：

結(jié)合凝固酶（即凝聚因子）：是一種結(jié)合于菌體細(xì)胞壁的酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白，而使葡萄球菌凝集成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此酶（凝聚因子）所致。

游離凝固酶：是凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原上，而被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法的陽性結(jié)果為此酶所致。

血漿凝固酶試驗(yàn)方法

玻片法：在1張潔凈玻片中央加1滴9g／L氯化鈉(生理鹽水)溶液，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽性和陰性對照） 制成菌懸液，若經(jīng)10～20s 內(nèi)無自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。5～10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。

試管法：用生理鹽水將新鮮兔血漿4倍稀釋，取0．5 ml于試管再加0.5ml待測菌濃菌懸液（需做陽性對照及陰性對照。），混勻后置37℃水浴中，每30min觀察1次結(jié)果。若3小時(shí)內(nèi)試驗(yàn)管和陽性對照管出現(xiàn)凝固，陰性對照管（即濃菌液管）不凝固，為陽性；若陰性，繼續(xù)觀察到24小時(shí)，不凝固者為陰性。如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。

（商品化）凍干血漿法：每支西林瓶加入0.5mL滅菌生理鹽水至完全溶解，然后加入葡萄球菌24h肉湯培養(yǎng)物0.3mL，充分混勻， 蓋好西林瓶膠塞，置于36±1℃培養(yǎng)，在6h內(nèi)定時(shí)觀察結(jié)果。結(jié)果觀察(如下圖所示)：傾斜或倒置試管時(shí)，呈現(xiàn)凝固塊，或凝固塊體積大于原體積的一半時(shí)，為血漿凝固酶陽性。觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)避免用力振動(dòng)西林瓶，以免凝塊振碎。

血凝固酶實(shí)驗(yàn)

血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用

本試驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。 

血漿凝固酶試驗(yàn)注意事項(xiàng)

玻片法：

10 秒內(nèi)觀察結(jié)果，如超過10 秒可出現(xiàn)假陽性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。 可選擇的玻片凝集試驗(yàn)法還包括檢測凝集因子和蛋白A的膠乳凝集試驗(yàn)。但膠乳凝集試驗(yàn)和玻片凝固酶試驗(yàn)的結(jié)果并不完全一致。

盡管膠乳凝集試驗(yàn)鑒定路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis）的可靠性較差，但鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統(tǒng)的玻片凝固酶試驗(yàn)。有些腐生葡萄球菌和松鼠葡萄球菌及某些微球菌屬的菌種可能膠乳凝集試驗(yàn)陽性，但玻片凝固酶試驗(yàn)通常陰性。 

a. 試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽性者，應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長時(shí)間（4H以上）孵育，才可出現(xiàn)陽性。

b. 如果培養(yǎng)時(shí)間超過4H，應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：
Ⅰ.延長培養(yǎng)時(shí)間后，有些菌株產(chǎn)生的葡萄球菌激酶（溶纖維蛋白酶），可以裂解凝塊，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；
Ⅱ.如果使用的血漿不是無菌的（或部分不是無菌的），假陽性和假陰性結(jié)果均有可能發(fā)生；
Ⅲ.所用待測菌不純，延長培養(yǎng)時(shí)間后，污染菌可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在這點(diǎn)上，含EDTA的血漿優(yōu)于檸檬酸鹽血漿，因?yàn)槔脵幟仕猁}的細(xì)菌（如一些鏈球菌）可能通過消耗檸檬酸鹽促進(jìn)凝集發(fā)生。
Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原（脫纖維血漿）。

試管法：須制備濃厚的均勻菌懸液，以便觀察結(jié)果。

最好用EDTA 抗凝的兔血漿，不主張用人的抗凝血，除非經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)其中不含感染因子、沒有凝血能力和沒有抑制因子。不同種動(dòng)物血漿因子不同，凝固狀態(tài)也不同，兔血漿凝塊結(jié)實(shí)，凝固速度快，優(yōu)于人血漿。

試驗(yàn)不可在高鹽培養(yǎng)基上的取菌落，因?yàn)榭赡艹霈F(xiàn)自凝或假陽性。

若被檢菌為陳舊的肉湯培養(yǎng)物（超過18～24H），或生長不良，凝固酶活性低的菌株可能檢測不出來。

為防止玻片法檢測的假陽性反應(yīng)，必須嚴(yán)格按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行操作。當(dāng)懷疑待測菌是金黃色葡萄球菌時(shí)，對玻片凝固酶陰性的結(jié)果應(yīng)做試管法凝固酶試驗(yàn)確證。玻片法和試管法凝固酶試驗(yàn)的血漿標(biāo)準(zhǔn)是:必須含有足夠濃度的凝固酶反應(yīng)因子和纖維蛋白原，必須無溶纖維蛋白活性和無抑制劑。

本試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性的葡萄球菌的肉湯培養(yǎng)物作為對照。 

商品化凍干血漿試劑需按照廠家提供的產(chǎn)品說明書使用及結(jié)果判讀。